微生物検査

・ 本症例での注意点
　微生物検査を依頼する場合には抗菌薬投与前の臨床検体を提出するのが基本である。ただし、抗菌薬投与中の臨床検体を提出する場合には抗菌薬の血中濃度が最も低い時期に検体を採取し提出することが望ましい。

PBP2：細胞形態の維持に必要な蛋白
PBP3：隔壁形成に関する蛋白

①左側上スライド
　腹腔内膿瘍の検体で、悪臭を伴う褐色の膿汁であった。

②右側（グラム染色像）スライド
　好中球には複数の貪食された細菌が多数認められ、周囲にもグラム陽性球菌からグラム陰性桿菌、グラム陽性桿菌などが多数観察された。

③左側下スライド
　培養検査の結果、好気性菌はEschrichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium と同定された。
　嫌気性菌はClostridium perfringens, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron と同定された。なお、 Clostridium spp.は周囲が不均一性の集落を形成する特徴がある。

・ 嫌気性菌を疑うポイント

1. 悪臭のある臨床検体
2. 閉鎖性の膿瘍（脳膿瘍、肺膿瘍、皮下膿瘍など）
3. 腹腔内感染症（肝膿瘍、横隔膜下膿瘍など）
4. 婦人性器感染症（膣炎、付属器炎など）
5. 塗抹検査陽性、好気培養陰性の検体
6. アミノグリコシド系薬が無効な感染症
7. 抗菌薬投与後の下痢症
8. ABPCやCEZが無効な感染症
9. 壊疽、土で汚染された壊死組織
10. 膿汁中のドルーゼ（硫黄顆粒、菌塊）

①左側スライド
　腹腔内膿をBTB乳糖加寒天培地に塗布し、35℃の好気的環境下で24時間培養した時の発育集落像を示した。 多数の細菌の発育が観察される。Klebsiella pneumoniae：2+は粘液性に富んだ細菌で、乳糖分解性のためBTB乳糖加寒天培地では黄色の集落を形成し、白金線などで集落に触れると糸を引く菌株もある。 Escherichia coli：2+は乳糖分解性のためBTB乳糖加寒天培地では黄色のR型集落を形成し易い。Enterobacter cloacae：1+は菌種により乳糖分解性がことなる。 集落はE. coliに比べてS型の集落を形成する。なお、本症例ではグラム陰性桿菌以外にヒツジ血液寒天培地にてEnterococcus faecalis：少数とStaphylococcus aureus（MRSA）：少数が検出された。

②右側スライド
　腹腔内膿をブルセラHK（RS）寒天培地に塗布し、35℃の嫌気的環境下で48時間培養した時の発育集落像を示した。ブルセラHK（RS）寒天培地には嫌気性菌のみならず通性嫌気性菌も発育するため多数の細菌の発育が観察される。このような症例では嫌気性菌の検出は難しくなるため必要に応じて選択培地の併用が望ましい。今回、嫌気性菌を検索した結果、グラム陰性桿菌のBacteroides fragilis：3+、 Bacteroides thetaiotaomicron：3+とグラム陽性球菌のPeptostreptococcus spp.：1+が検出された。

・腸管出血性大腸菌（ EHEC：enterohemorrhagic E. coli ）の特徴

1. 大腸粘膜に付着して増殖する際にベロ毒素（2種類）を産生する。この毒素は志賀赤痢菌が産生する毒素と同一ためShiga toxin（Stx）とも呼ばれる．そのため、ベロ毒素産生大腸菌（VTEC）や志賀毒素産生大腸菌（STEC）とも言われる。
2. 溶血性尿毒症症候群や脳症などの合併を起こし、死亡することがある。
3. 血清型はO157：H7が有名、その他　O26：H11、O111:H2、O128:H7、O145:H8などがある。
4. 鮮血便を伴う下痢を起こす。血液像では赤血球の破壊した破砕赤血球像が観察される。
5. ウシの常在細菌となる事が多く、牛肉や便で汚染された野菜なども原因食品になる。
6. 選択培地にはソルビトールマッコンキー寒天培地などがある。

①左側スライド
　ソルビトールマッコンキー寒天培地はマッコンキー寒天培地の乳糖の代わりにソルビトールを添加して作製した培地で、腸管出血性大腸菌はソルビトール利用能がない性質を利用した選択培地である。そのため、集落は無色から薄いピンク色の色調を呈する。

②右側スライド
　病原大腸菌をソルビトールマッコンキー寒天培地にて培養した集落の色調を示した。病原大腸菌はソルビトール利用能があるためピンク色の色調を呈する。

・マッコンキー寒天培地の主な組成
　乳糖 １％、胆汁酸 0.1％、NaCl 0.5％、指示薬：ニュートラルレッド

・SS寒天培地の主な組成
乳糖 １％、胆汁酸　0.9％、クエン酸Na　0.85％、チオ硫酸Na 0.55%、
クエン酸第二鉄　0.1％、ブリリアントグリーン、指示薬：ニュートラルレッド

・DHL寒天培地の主な組成
乳糖 1%、白糖　1%、デオキシコール酸Na　0.1％、クエン酸Na　0.1％、
チオ硫酸Na 0.23%、クエン酸鉄アンモニウム　0.1％、指示薬：ニュートラルレッド

・微生物検査において最初に実施されるのが、塗抹標本によるグラム染色である。
下記にグラム染色の手順を示す。

① 臨床検体をスライドグラスに塗布する
　↓
② 自然乾燥後、火炎固定またはメタノール固定を実施する
　↓
③ 自然乾燥後、前染色液であるクリスタル紫液にて染色する
　↓
④ 水洗後、媒染液のルゴール液を滴下する
　↓
⑤ 水洗後、純アルコール液かアルコール・アセトン液にて脱色する
　↓
⑥ 水洗後、後染色液であるサフラニン液にて染色する
　↓
⑦ 水洗後、光学顕微鏡にて観察する。

・本アトラス集は、著者が佐賀大学医学部附属病院検査部にて経験した症例を中心に掲載し、実際に判断に迷った症例や臨床微生物学を学習するうえで必要な資料を解説と共に掲載した。

・臨床検体からのグラム染色による細菌の推定では、貪食像や抗菌薬投与による形態変化、さらには検体の保存期間による染色性の劣化など多くの要因が関与する。従って、実際には光学顕微鏡にて判断した推定菌種と培養検査で発育した菌種の間で乖離がみられることがある。

・臨床検体から起炎菌を推定する場合、多くの細菌は属レベルでの判定に留まることが多い。例えば、ブドウ球菌とは推定できても、その細菌が黄色ブドウ球菌かコアグラーゼ陰性のブドウ球菌かを鑑別することは経験者でも非常に難しい。そのため、本アトラス集を参考に出来る限り起炎菌の推定が普及することを期待している。

・微生物検査においてグラム染色の次に実際されるのが培養検査である。
　下記に培養検査に関する概要を記載する。

① 分離培地

• 分離培地には水、肉水・肉エキス、ペプトン、寒天、増強成分、化学薬品・指示薬などが含まれている。
  　分離培地には選択分離培地と非選択分離培地の２種類があり、臨床材料から分離される細菌の種類によって使い分けられている。特に選択培地は目的菌以外の細菌の増殖を抑制し、特定菌種の発育を目的とする場合に使用される。
  （例）非選択分離培地：BTB乳糖加寒天培地、血液寒天培地など
  　　　選択分離培地：SS寒天培地、TCBS寒天培地など

②培養条件

• 酸素の要求性により、偏性好気性菌、通性嫌気性菌、偏性嫌気性菌、微好気性菌に大別される。
  （例）偏性好気性菌：緑膿菌、炭疽菌など（遊離酸素濃度：21％必要）
  　　　通性嫌気性菌：大腸菌、ブドウ球菌など（酸素の存在は関係ない）
  　　　偏性嫌気性菌：破傷風菌、ボツリヌス菌など（酸素がない条件が必要）
  　　　微好気性菌：ヘリコバクター、カンピロバクターなど
  　　　（遊離酸素濃度：3～15％必要）
• 至適温度：35～37℃が大部分
• 至適pH：6～7が大部分

・腸管出血性大腸菌（ EHEC：enterohemorrhagic E. coli ）の特徴

1. 大腸粘膜に付着して増殖する際に、ベロ毒素（2種類）を産生する。この毒素は志賀赤痢菌が産生する毒素と同一ためShiga toxin（Stx）とも呼ばれる。そのため、ベロ毒素産生大腸菌（VTEC）や志賀毒素産生大腸菌（STEC）とも言われる。
2. 溶血性尿毒症症候群や脳症などの合併を起こし、死亡することがある。
3. 血清型はO157：H7が有名、その他　O26：H11、O111:H2、O128:H7などがある。
4. 鮮血便を伴う下痢を起こす。血液像では赤血球の破壊した破砕赤血球像が観察される。
5. ウシの常在細菌となる事が多く、牛肉や便で汚染された野菜なども原因食品になる。

・ Klebsiella pneumoniae の特徴

1. 莢膜を保有するグラム陰性桿菌（0.3～1.0×0.6～6.0µm）で非運動性、肺炎桿菌と呼ばれる。
2. ムコイド状（＞5mm以上の粘性糸で鑑別）を呈する菌株は肝膿瘍などを発症するリスクが高い。
3. ヒトでは呼吸器、尿路感染の原因菌となる。
   ※近年はESBL、KPCなどの耐性菌が院内感染として問題となっている。

②右側（ E. coli ）スライド
　E. coli の大部分は乳糖分解のためBTB乳糖加寒天培地では黄色のS型集落を形成する。

・ Eschrichia coli の特徴

1. グラム陰性桿菌（0.4～0.7×1.0µm）で周毛性鞭毛を持ち運動する。
   ※鞭毛を欠いて非運動性でガス非産生の菌株も有り。
2. ヒトや動物の腸管内常在菌である。
3. 遺伝子学的相同性では赤痢菌と鑑別できない。
4. 土壌や水の中では数カ月生存可能で、自然界には比較的抵抗性がある。

・BTB乳糖加寒天培地に発育したEschrichia coli のムコイド型（M型）およびAlkalescens-Dispar の症例を提示する。

①左側（Eschrichia coli のムコイド型：M型）スライド
　Eschrichia coli の大部分は乳糖分解のためBTB乳糖加寒天培地では黄色のS型集落を形成するが、Klebsiella pneumoniae と見間違えるM型集落を形成する場合があるので注意する。

②右側（Eschrichia coli のAlkalescens-Dispar ）スライド

1. Shigella spp.の生物学的反応に類似したE. coli をAlkalescens-Disparと呼ぶ。
2. ガス非産生, 非運動性および乳糖非分解または遅発酵性である。
3. O抗原がE. coli と密接な関係を持つ。
4. 下痢症で分離されることが多い。

①左側（運動性の確認）スライド
　腸内細菌科細菌の運動性を確認する場合には無染色生鮮標本およびSIM培地による方法が実施されている。SIM培地で運動性を確認する場合、穿刺の状況によっては判定に苦慮する場合を経験する。そこで簡易に運動性を確認する方法を紹介する。

1. SIM培地を2本用意し、湯煎にて寒天を溶かす。
2. 滅菌シャーレに溶かしたSIM培地を注いで固める。
3. 対象菌種を寒天の中層部まで接種し培養する。

②右側スライド
　Hafnia alvei は腸内細菌科細菌に属するグラム陰性の通性嫌気性桿菌で、30℃までは運動性を認めるが、それを超える温度では運動性を失うことが多い。土壌や水中、動物の腸管内に存在し、ヒトにおける日和見感染の原因菌のひとつである。

・レイフソン（Leifson）染色

　①②③を等量ずつ混合し、室温に2時間放置後濾過せずに冷蔵庫にて保存する。室温放置では数日で使用不能になるが、冷蔵庫では2ヶ月、-20℃の冷凍庫では1年以上は安定である。